La represión de los indígenas de los valles calchaquíes, la entrega en mita de muchos de ellos para trabajar en las minas del Potosí, el proceso de mestizaje, y sobre todo el colapso demográfico de la población indígena, hicieron que las encomiendas que alguna vez florecieran en el Tucumán fueran menguando.
En la segunda mitad del siglo XVI, tanto el Alto Perú, el Tucumán, como el Paraguay exigían la creación de un puerto en el Atlántico sur para poder establecer lazos de comercio más cercanos con España y a la vez disminuir su aislamiento. Es por estos motivos, y por la amenaza de incursiones extranjeras en el Río de la Plata que la Corona española autoriza la segunda fundación de Buenos Aires.
En el Río de la Plata, la colonización se había concentrado en el Paraguay, donde los guaraníes eran numerosos y sedentarios, pasibles de ser encomendados. En 1573 el gobernador Juan de Garay marchó a repoblar Buenos Aires. En el camino, decidió fundar en el lugar una ciudad intermedia: Santa Fe de la Vera Cruz.
La tarea se completó en 1580, cuando fundó la ciudad de Trinidad y Puerto de Santa María del Buen Ayre, que con el tiempo sería conocida como Ciudad de Buenos Aires, como parte del Virreinato del Perú.
Durante el último tercio del Siglo XVI, gracias a la introducción de la técnica de la amalgama con mercurio, la producción de plata se había duplicado, como así también la mortalidad de los indígenas. El llamado "Valle Imperial", llegó a tener una población de 160.000 habitantes y se convirtió en el principal mercado de consumo de Hispanoamérica. En este contexto, Buenos Aires se convierte en la entrada y salida natural de los productos altoperuanos y del Paraguay. Por un lado entran insumos y miles de esclavos negros para reemplazar a la menguante población indígena y por otro lado sale la plata producida en el cerro de Potosí.
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